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  本研究以肠道乳酸菌和双歧杆菌低丰度但潜在有益亚群的年龄相关变化为着眼点，对四个年龄组的肠道乳酸菌和双歧杆菌的基因特征、多样性、微生物群组成及OTU等进行一系列研究。

  长寿是由自身因素（性别、遗传等）和外因（地理位置、生活方式等）决定的复杂多因素表型。最近研究证实，这一些因素大部分都会影响与人类健康相关的肠道微生物群。而肠道微生物群失调与多种疾病相关，如代谢疾病、胃肠道疾病、自身免疫性疾病、精神/心理疾病等。因此，进一步探索人类肠道菌群及其与衰老和长寿的关系，对于维持肠道内环境平衡和帮助老年人实现健康至关重要。研究之后发现肠道双歧杆菌和乳酸菌是对身体有好处的菌群，具有促进宿主营养吸收和代谢的调节等重要的生理功能，但因其在肠道中占比相对较少，加上常规测序技术注释分辨率有限，阻碍了肠道乳酸菌和双歧杆菌的精细分析。因此，本研究选用两对实验室研究的特异性引物结合PacBio测序技术在物种水平上解析乳酸菌和双歧杆菌微生物群谱，极大的帮助了我们研究长寿人群肠道中低丰度但有潜在有益作用的乳酸菌和双歧杆菌。

  本研究发现：（1）受试者的年龄与肠道中双歧杆菌的α多样性呈负相关关系，而在肠道乳酸菌中未观察到这种相关性。（2）主坐标分析（PCoA）和操作分类单元（OTUs）分布分析表明，长寿老人组肠道双歧杆菌亚群的结构和组成与其他三个年龄组有较大差异，年轻人组的肠道乳酸菌亚群与三个老年人群的肠道乳酸菌亚群显著不同。（3）确定了几种潜在有益细菌（如Bifidobacterium breve和Bifidobacterium longum），它们在长寿老人组中富集（P0.05），且Bifidobacterium adolescentis的相对丰度随年纪的增加而显著下降（P0.05）。虽然双歧杆菌和乳酸菌通常被认为是促进健康的类群，但它们的年龄依赖性分布不同，表明它们的生命阶段变化不同，潜在的功能作用也不同。本研究为物种水平上肠道双歧杆菌和乳酸菌微生物群谱提供了大量研究对象，确定了几个与年龄或寿命相关的特征和生物标志物。

  本试验招募了来自9个不同城市的4个年龄组受试者，即长寿老人组（≥ 90岁，15人）、老年人组（75~87岁，56人）、年轻老年人组（65~74岁，12人）和年轻成年人组（20~28岁，32人），共收集了105名参与者的粪便样本。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit对105份粪便样本做DNA提取，用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop分光光度计检测DNA质量。以纯化的宏基因组DNA作为模板，用特异性引物对乳酸菌和双歧杆菌进行PCR扩增，选用两对特异性引物（这些引物是我们实验室之前设计的）结合PacBio测序技术在物种水平上解析乳酸菌和双歧杆菌微生物群谱。

  1肠道乳酸菌和双歧杆菌微生物群的数据集特征和α多样性从105份样品中产生了343,580个高质量序列（双歧杆菌252,930个，乳酸菌90,650个）。三个组的双歧杆菌Shannon多样性指数值相近，仅是年轻老人组明显高于长寿老人组（P0.05）。年轻人组观察到的双歧杆菌OTU数量明显低于年轻老人组和老人组（P0.01），而年轻人组和长寿老人组间未观察到显著差异（图1b）。四个组间的乳酸菌多样性和物种数量无显著差异（图1c）。此外，随年纪的增加，双歧杆菌亚群的多样性和物种数量轻微显著减少（P0.06）；乳酸菌微生物群中未观察到这种趋势（图1d，1e）。

  2肠道乳酸菌和双歧杆菌微生物群的β多样性为了将不同年龄组间肠道双歧杆菌和乳酸菌群落结构的差异可视化，进行了PCoA分析。双歧杆菌的PCoA图未表现出明显的聚类模式（图2a），除了代表长寿组的大多数符号分布在PCoA图的右侧，根据结果得出长寿组的肠道双歧杆菌微生物群结构可能与其他年龄组的肠道双歧杆菌结构不同。相似性分析（ANOSIM）进一步分析证实，长寿组的双歧杆菌微生物群结构与其他组有显著差异（R=0.066~0.114；P=0.001~0.015；图2b），也揭示了年轻人组和年轻老人组间的显著差异（R=0.05，P=0.003）；年轻人组与老年人组间无显著差异（R=0.02，P=0.23；图2b）。相比之下，代表年轻人组肠道乳酸菌微生物群的符号与三个老年组明显不同，该集群向与老年人组不同的方向挪动，表明年轻人的肠道乳酸菌亚群与老年人群明显不同（图2c）。ANOSIM证实了年轻人组和老年组间肠道乳酸菌微生物群存在非常明显差异（R=0.095~0.11；P=0.001，年轻人组与三个老年组比较），而三个老年组之间未发现显著差异（图2d）。

  3四个年龄组肠道双歧杆菌和乳酸菌群的组成在所有样品检测到30种双歧杆菌，双歧杆菌微生物群中具有高丰度的优势物种是B. breve（29.93%）、B. catenulatum（24.74%）、B. adolescentis（20.74%）、B. dentium（12.97%）和B. bifidum（5.01%）。有趣的是，长寿老人组中检测到相对较多的B. breve序列（67.59%），而年轻人组中检测到相对较多的B. adolescentis（42.30%）。此外，B. adolescentis的相对丰度随年龄的增长呈下降趋势（年轻人组为42.30%；年轻老人、老人和长寿老人组分别为18.54%、11.23%和5.71%）。 在所有样品检测到118种乳酸菌，乳酸菌微生物群中具有高丰度的优势物种是S. sanguinis（17.92%）、Vagococcus fessus（13.78%）、 L . saerimneri（12.80%）、L. murinus（6.33%）和S. parauberis（4.86%）。三个老年组的 V. fessus （17.04%）和 S. sanguinis （17.02%）的相对丰度较高，而L. saerimneri（38.71%）和S. sanguinis（19.97%）是年轻人组中的优势物种。年轻人组和老年人组肠道乳酸菌微生物群优势种的不同特征与PCoA分析中观察到的一致，这表明这些优势物种是造成肠道乳酸菌微生物群结构差异的根本原因。 为辨别特定年龄的差异丰富物种，比较了四个年龄组中检测到的双歧杆菌和乳酸菌物种的相对丰度（图3）。年轻人组与其他3个老年组间发现3种双歧杆菌、14种乳酸菌的相对丰度差异显著；长寿老人组和其他三组间发现2种双歧杆菌、1种乳酸菌的相对丰度差异显著。肠道双歧杆菌微生物群，在长寿老人组中发现了更多的B. breve、B. longum、B. saguini和B. animalis序列（P0.05；图3）；尤其是长寿老人组B. breve和B. longum的相对丰度明显高于3个年龄组（P0.01；图3）。此外，与三个老年组相比，年轻成人组中检测到的B. adolescentis和B. bifidum明显更多（P0.01；图3）。对于肠道乳酸菌微生物群，年轻人组和三个老年组间差异丰富的物种是L. murinus、L. saerimneri、L.sanfranciscensis、V. fessus和L. brevis（P0.05；图3）。需要我们来关注的是，年轻人组中检测到的L. saerimneri序列明显多于三个老年组（P0.05；图3）。

  4四个年龄组中双歧杆菌和乳酸菌核心、常见和独特的OTU进一步调查了四个不同年龄组常见和特有OTU的分布情况，在完整的数据集鉴定出1,006个双歧杆菌OTU，其中9个无法鉴定到物种水平，大多数OTU属于B. breve（51.5%）、B. catenulatum（35.39%）和B. adolescentis（10.54%）（图4a）。共鉴定出113个乳酸菌OTU，其中14个无法鉴定到物种水平，大多数OTU属于S. salivarius（20.35%）、L. delbrueckii（7.96%）、S. parasanguinis和L. mucosae （5.31%; 图4b）。老年人组含有更多独特的双歧杆菌（13,451个）和乳酸菌（3,003个）OTU，而长寿老人组的独特OTU最少（双歧杆菌371个，乳酸菌63个）。 “核心微生物群”的概念用于识别和描述微生物群落中稳定和永久的关键微生物。核心OTU被定义为存在于每组样本中≥50%的OTU。与其他三组相比，长寿老人组的双歧杆菌OTU丰富度最高，包含158个独特的核心OTU，除1个B. catenulatumOTU外，均属于B. breve。长寿老人组和年轻人组共有15个核心乳酸菌OTU，分别为B. breve和B. bifidum（图4c）。三个老年组共有24个核心OTU，其中有三个无法在物种水平上进行识别。优势核心物种包括S. salivarius（20.83%）、L. mucosae和L. delbrueckii（12.5%）。在三个老年组和年轻人组间未发现共同的核心乳酸菌OTU（图4d）。与其他三组相比，老年人组中未发现独特的核心双歧杆菌和乳酸菌OTU。综上所述，对于双歧杆菌，长寿组的独特OTU数量最少，但独特核心OTU数量最多；而在老年人组中，情况相反。

  本研究进行了一项横断面调查，以生成3个年龄段老年人肠道乳酸菌和双歧杆菌的准确分类图，并将老年人的肠道微生物群与年轻人的肠道微生物群进行了比较。α多样性反映了微生物群落的多样性和丰富度，研究之后发现，随着老年受试者年龄的增加，肠道双歧杆菌的多样性和数量减少。相比之下，虽然年轻人和老年人群的肠道乳酸菌亚群存在非常明显差异，但肠道乳酸菌多样性及丰度与年龄间无显著相关性。根据结果得出，肠道双歧杆菌比乳酸菌亚群更受年龄的影响，长寿老人的双歧杆菌的多样性明显低于老年组，肠道双歧杆菌的多样性确实随年纪的增长呈下降趋势，这与Hopkins和MacFarlane等人的结果一致。此外，本研究在应用PacBio SMRT测序技术对双歧杆菌和乳酸菌特异性引物产生的扩增子进行测序、靶向肠道乳酸菌和双歧杆菌菌群方面是独特且新颖的。 有报道发现百岁老人的肠道细菌群落与年轻和老年受试者的肠道细菌群落是分开聚集的。本研究根据结果得出，长寿组的肠道双歧杆菌微生物群的组成与其他年龄组不同，主要的年龄差异物种是 B. breve 、B. longum和B. adolescentis，尤其是在长寿组的肠道中检测到更高的B. breve和B. longum的相对丰度。然而，Kato等人发现，在日本各个健康年龄段的肠道中都广泛检测到B. longum，而B. breve在年轻人中更丰富。这些不同的发现可能与招募对象的不一样的种族和别的环境因素的差异有关（如生活小习惯、饮食和地理区域）。 本研究表明，除了作为优势物种外，长寿老人组的许多核心和独特的OTU都属于B. breve，且与E. faecalis呈强负相关性，这表明B. breve可能对潜在致病性肠道细菌有抑制作用，也表明了B. breve是一种有助于延长寿命的有益物种。本研究还发现，长寿老人组的独特核心OTU数量最多。年轻人和老年组的肠道乳酸菌微生物群具有显著不同的特征，确定了一些与年龄相关的物种（如：L. murinus、L. sanfranciscensis、 V. fessus 、L. curvatus和L. helveticus）在三个老年组中均普遍显著，相比之下，L. saerimneri、L. ruminis、R. flavefaciens、W. confusa和W. ghanensis在年轻人组中更为普遍。之前的一篇报道发现L. saerimneri具有有效的肿瘤坏死因子（TNF）抑制活性（70%抑制），而L. ruminis通过激活THP-1单核细胞中TNF的产生而表现出免疫刺激特性，因此人类肠道栖息的两种物种都能够大大减少炎症和器官损伤。本研究显示L. saerimneri和S. sanguinis间显著负相关，表明L. saerimneri对S. sanguinis具有潜在的抑制作用（S. sanguinis是一种与龋齿和牙周炎相关的口腔致病性厌氧菌）。因此，衰老可能与老年人肠道中有益物种（如L. saerimneri 和 L. ruminis）的减少甚至缺失有关。当前数据集的相关性分析表明，肠道双歧杆菌和乳酸菌亚群微生物群网络的复杂性随年龄而变化，在长寿老人组中，这些物种之间相互作用的复杂性最高。B. catenulatum是本研究中四个年龄组间的优势种，它与一些优势种（B. breve和B. longum）呈负相关。 综上所述，我们的研究发现了物种水平的肠道双歧杆菌和乳酸菌微生物群有趣的年龄依赖性特征，长寿老人的肠道具有独特的特征，且其中富含潜在益生菌物种B. breve和B. longum。虽然在健康衰老与潜在有益肠道微生物亚群之间得出任何因果关系还为时过早，但这些与年龄相关的物种可能作为衰老和/或长寿的微生物生物标志物。

  本研究以肠道乳酸菌和双歧杆菌低丰度但潜在有益亚群的年龄相关变化为着眼点，对四个年龄组的肠道乳酸菌和双歧杆菌的基因特征、多样性、微生物群组成及OTU等进行一系列研究。（1）发现肠道双歧杆菌微生物群的α多样性随年纪的增长而下降，而乳酸菌无变化；长寿组肠道双歧杆菌亚群的结构和组成与其他三个年龄组有较大差异；在长寿老年人群中富集的几种潜在有益细菌（如B. breve和B. longum）。（2）在应用PacBio SMRT测序技术对双歧杆菌和乳酸菌特异性引物产生的扩增子进行测序、靶向肠道乳酸菌和双歧杆菌菌群方面是独特且新颖的。（3）为新物种水平的肠道双歧杆菌和乳酸菌微生物群谱提供了大量研究对象，确定了几个与年龄或寿命相关的特征和生物标志物。